谷胱甘肽位点鉴定


谷胱甘肽是一种小分子三肽物质(c-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine),以还原形式(GSH)或者氧化形式(GSSG)存在,两个谷胱甘肽分子通过二硫键连接形成氧化形式(GSSG)。通常以还原形式存在于大多数细胞中,在大多数植物体中,谷胱甘肽还被认为在许多其他过程中起重要作用,包括开花,细胞分化,程序性细胞死亡,病原体抗性,共生或者细胞周期调控等。

最新研究发现谷胱甘肽参与一种翻译后修饰过程,即谷胱甘肽化。S-硫醇化反应是在小分子量硫醇和半胱氨酸硫醇之间形成的一种二硫化合物,谷胱甘肽反应是S-硫醇化反应的主要形式。这种修饰显然主要发生在氧化应激条件下,但是可能在正常条件下也可能起重要作用,特别是对几个硫醇过氧化物酶的再生

谷胱甘肽可能是一种重要的氧化还原信号机制,允许细胞感知和发出有害的应激条件信号,并触发适当的反应,已经证明了蛋白谷胱甘肽化参与几个信号转到通路的调控。既然该修饰在应激反应和适应性中的潜在重要性,目前已经开发出许多方法来识别和分析发生谷胱甘肽的蛋白质。

目前最常见的几种检测谷胱甘肽化蛋白质的主要方法:

生物素化的谷胱甘肽(Biotinylated Glutathione)

生物素化谷胱甘肽可以很容易地在体外合成为还原形式(BioGSH)和氧化形式(BioGSSG),还原型谷胱甘肽的一种类似物,谷胱甘肽乙基酯(GEE),也可用来产生一种膜渗透形式的生物素化谷胱甘肽(BioGEE)。生物素集团在谷胱甘肽上的存在,可以通过非还原型non-reducing WB和生物素抗体等方法,灵敏有效的检测谷胱甘肽蛋白。生物素标记的谷胱甘肽也可以用于体内谷胱甘肽化蛋白质组学的鉴定。

谷胱甘肽抗体(Anti-Glutathione Antibodies)

谷胱甘肽蛋白也可以使用商业化的谷胱甘肽抗体检测。可以通过1D或者2D凝胶电泳,免疫沉降,或者细胞免疫定位等方法检测谷胱甘肽化蛋白,目前可用的谷胱甘肽抗体可以用于分析单个蛋白,但不适用于通过蛋白质组学方法大规模检测谷胱甘肽蛋白。

GRX还原谷胱甘肽化蛋白(Reduction of Glutathionylated Proteins by GRX)

全蛋白溶液与N-乙基马来酰亚胺(NEM)发生烷基化,封闭所有游离的硫醇。经过单核半胱氨酸GRX的还原后,新获得的硫醇胺被NEM-biotin衍生为标记最初在全蛋白溶液中发生谷胱甘肽化的蛋白质,这些蛋白质然后通过亲和层析纯化,并通过蛋白质组学分析如上所述使用生物素化的谷胱甘肽处理后进行质谱鉴定。具体流程如下图所示:

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