蛋白质瓜氨酸修饰

蛋白质瓜氨酸翻译后修饰是通过蛋白精氨酸脱亚氨酶(PAD)家族蛋白催化发生,瓜氨酸异常累

蛋白瓜氨酸修饰是最为广泛,研究最为深入的蛋白翻译后修饰之一,在细胞生理学中扮演着至关重要的作用。磷酸化过程在生物体中是可逆的,并且通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶在真核和核生物中起着磷酸化调控的作用。据估计细胞中1/3的蛋白同时发生磷酸化,所有的生命过程都通过此修饰直接或者间接的进行调控。

加与许多炎症疾病和癌症有关,而PAD抑制剂在一系列疾病中包括风湿性关节炎、红斑狼疮、动脉粥样硬化和溃疡性结肠炎具有显著疗效。瓜氨酸化蛋白可能更广泛地作为特定疾病状态的生物标注物,然而由于瓜氨酸化后发生的较小的1Da质量变化,瓜氨酸化残基的识别仍然具有挑战性。瓜氨酸蛋白是由精氨酸脱亚胺酶(PAD)家族的酶对肽基精氨酸进行脱亚胺作用而产生的,如图1所示。

显色法

此种检测(COlor DEvelopment Reagent)是通过将瓜氨酸中特有的尿素集团进行化学衍生化,反应过程是用二乙酰单氧肟对尿素进行酸催化改性,此法目前常用在体外检测PAD活性,其缺点是检测灵敏度差,但是检测限较高(~60nmol),因此不适合用于蛋白浓度较低的样本。

抗体法

抗体检测系统针对低浓度蛋白样本相对更为灵敏,抗体是通过重组蛋白产生的,经过脱亚胺处理后,然后在酸性条件下与二乙酰单氧肟和替比林发生衍生反应。抗体可以识别体外脱亚胺的大鼠垂体蛋白,后来被用广泛应用作检测瓜氨酸蛋白的商业试剂盒

质谱法

由于精氨酸残基留在脱亚胺过程中发生质量的微小变化,质谱法检测瓜氨酸也具有较高的挑战性,观察到的肽质量增加是0.98Da。这种微笑的变化,再加上体内瓜氨酸的含量较低,很容易与13C同位素或脱氨情况发生混淆。另一常见的难度是精氨酸脱亚胺引起的蛋白酶裂解变化----通过中和精氨酸残基的正电荷,在带正电荷残基(如胰蛋白酶)后选择性裂解的蛋白酶在脱亚胺反应形成瓜氨酸后不再裂解。

化学衍生化+质谱法

为了使质谱检测手段能够检测到瓜氨酸蛋白的可能性,科学家通过使用2,3-丁二酮或者结合安替比林进行衍生化,如图2所示,这样可使其发生瓜氨酸转化的肽段,分子量分别增加50和238Da,使得这些瓜氨酸的肽段能通过质谱手段与其他肽段进行区分。

RhPG探针法

为由于瓜氨酸蛋白丰度较低,从非瓜氨酸蛋白中富集感兴趣的瓜氨酸蛋白能大大提升复杂蛋白样本中瓜氨酸蛋白的检测水平。为此,利用类似于2,3-丁二酮衍生化的方法,开发了瓜氨酸的化学探针。苯乙二醛可在酸性环境中与瓜氨酸中的尿素集团特异性地发生环化,如图2所示。根据前面的实验方法概念,又通过罗丹明标记的苯甲酰甲醛探针(RhPG)如图3所示,去标记复杂混合物中的瓜氨酸蛋白。

相对于其他检测方法,RhPG检测限较低(~20fmol瓜氨酸化蛋白PAD4),因此可以用来监测蛋白瓜氨酸化的动力学,由于具有一定的优势,且该检测方法的高通量,许多样本也可以同时进行检测和比较。

为将这个实验方法和MS结合,又有方法通过使用4-溴苯乙二醛(如图3所示)选择性的标记瓜氨酸多肽,然后在MALDI-MS分析中利用溴的特征来明确区分标记肽和其他的多肽。为了进一步改进MS对复杂蛋白和多肽混合物的分析,也可以将生物素与苯乙二醛集合 ,生产生物素-PG(BPG)(如图3)用于链霉亲和素结合。

结合之后再通过蛋白酶进行消化,通过MS手段对其进行分析。瓜氨酸修饰已经被证明是多种PAD活性失调的疾病的重要生物标记物,检测瓜氨酸化蛋白的方法具有灵敏性和特异性,可用于识别新的疾病相关的瓜氨酸修饰,并为多种疾病的早期检测提供诊断方法。近年来化学衍生法结合质谱手段检测瓜氨酸化修饰取得了较大的进展,使人们了解瓜氨酸化蛋白的普遍性及其与多种疾病的相关性。

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